Стандартизированный мульти - Лоу ПИМ Групп, ООО

Природная микробиология, том 7, страницы 2128–2150 (2022 г.) Процитировать эту статью

29 тысяч доступов

11 цитат

186 Альтметрика

Подробности о метриках

Несмотря на достижения в секвенировании, отсутствие стандартизации затрудняет сравнение результатов исследований и затрудняет понимание структуры и функций микробных сообществ во многих средах обитания в планетарном масштабе. Здесь мы представляем мультиомный анализ разнообразного набора из 880 образцов микробного сообщества, собранных для проекта «Микробиом Земли». Мы включаем данные ампликона (16S, 18S, ITS) и метагеномных последовательностей дробовика, а также нецелевые метаболомные данные (жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия и газовая хроматография-масс-спектрометрия). Мы использовали стандартизированные протоколы и аналитические методы для характеристики микробных сообществ, уделяя особое внимание взаимосвязям и совместному распространению связанных с микробами метаболитов и микробных таксонов в различных средах, что позволило нам исследовать разнообразие в необычайных масштабах. В дополнение к справочной базе данных метагеномных и метаболомных данных мы предоставляем основу для включения дополнительных исследований, позволяющих расширить существующие знания в форме развивающегося ресурса сообщества. Мы демонстрируем полезность этой базы данных, проверяя гипотезу о том, что каждый микроб и метаболит находятся повсюду, но среда выбирает их. Наши результаты показывают, что разнообразие метаболитов демонстрирует круговорот и вложенность, связанные как с микробными сообществами, так и с окружающей средой, тогда как относительное содержание микробных метаболитов варьируется и встречается одновременно со специфическими микробными консорциумами в зависимости от среды обитания. Мы дополнительно показываем силу определенных химических веществ, в частности терпеноидов, в различении земной среды (например, поверхности и почвы наземных растений, пресноводных и морских животных), а также некоторых микробов, включая Conexibacter woesei (наземные почвы), Haloquadratum. walsbyi (морские отложения) и Pantoea dispersa (детрит наземных растений). Этот ресурс дает представление о таксонах и метаболитах микробных сообществ из различных сред обитания по всей Земле, дает информацию как о микробной, так и о химической экологии, а также обеспечивает основу и методы для мультиомных исследований микробиома хозяев и окружающей среды.

Основная цель микробной экологии — понять структуру микробных сообществ, как она связана с таксономическим, филогенетическим и функциональным составом микробов и как эти отношения изменяются в пространстве и времени. Поскольку ни одно исследование не может повторно отобрать все среды, чтобы сделать такие выводы, содействие использованию стандартизированных методов, позволяющих проводить метаанализ в рамках отдельных исследований, имеет первостепенное значение1,2,3,4. Первоначальные усилия были сосредоточены на стандартизированных протоколах секвенирования 16S рибосомальной РНК (рРНК) бактериальных/архейных сообществ, что позволило понять, как структурируются сообщества в окружающей среде, поддерживая четкое разделение микробов по градиентам ассоциации с хозяином и солености1,5. Более поздние усилия, сосредоточенные на данных дробовой метагеномики6,7,8,9, начали давать дополнительную информацию о функциональном потенциале в различных средах10,11,12,13,14, а современные современные методы используют подходы мультиомики. включая метагеномику, транскриптомику, протеомику и/или метаболомику15,16,17,18,19,20,21,22,23,24.

Микробы производят разнообразные вторичные метаболиты, которые выполняют жизненно важные функции – от коммуникации до защиты25,26,27 и могут принести пользу здоровью человека и экологической устойчивости28,29,30,31,32,33,34. В то время как добыча метагенома и транскриптомика являются мощными способами характеристики функций микробных сообществ10,14,24, более мощный подход к пониманию функционального разнообразия заключается в получении химических доказательств, подтверждающих наличие метаболитов19,20,21 и точно описывающих их распространение по Земле. Здесь мы представляем подход, который напрямую оценивает наличие и относительную распространенность метаболитов и обеспечивает точное описание профилей метаболитов в микробных сообществах в окружающей среде Земли. Хотя в нескольких исследованиях ранее использовалась тандемная метагеномика и метаболомика22,23,35,36,37,38,39,40, во многих из них применялись относительно ограниченные технические методы или профилировалось относительно небольшое количество классов метаболитов23,35,40, что не позволяло сравнивать исследования между собой. это могло бы расширить наше понимание. Кроме того, некоторые предыдущие исследования ограничивались одной средой обитания или средой обитания20,23,24,35,36,37,38,39. Наша работа существенно выходит за рамки того, что сообщалось ранее в отношении мультиомного анализа микробных сообществ с использованием метагеномики и метаболомики, за счет включения нескольких экосистем. Применяемый нами подход дополняет метагеномику прямым исследованием вторичных метаболитов с использованием нецелевой метаболомики.

1.5–2 kb DNA fragments’ (Oxford Nanopore Technologies). The resulting product consists of uniquely tagged rRNA operon amplicons. The uniquely tagged rRNA operons were amplified in a second PCR, where the reaction (100 µl) contained 2 U Platinum SuperFi DNA Polymerase High Fidelity (Thermo Fisher) and a final concentration of 1X SuperFi buffer, 0.2 mM of each dNTP, and 500 nM of each forward and reverse synthetic primer targeting the tailed primers from above. The PCR cycling parameters consisted of an initial denaturation (3 min at 95 °C) and then 25–35 cycles of denaturation (15 s at 95 °C), annealing (30 s at 60 °C) and extension (6 min at 72 °C), followed by final extension (5 min at 72 °C). The PCR product was purified using the custom bead purification protocol above. Batches of 25 amplicon libraries were barcoded and sent for PacBio Sequel II library preparation and sequencing (Sequel II SMRT Cell 8M and 30 h collection time) at the DNA Sequencing Center at Brigham Young University. Circular consensus sequencing (CCS) reads were generated using CCS v.3.4.1 (https://github.com/PacificBiosciences/ccs) using default settings. UMI consensus sequences were generated using the longread_umi pipeline (https://github.com/SorenKarst/longread_umi) with the following command: longread_umi pacbio_pipeline -d ccs_reads.fq -o out_dir -m 3500 -M 6000 -s 60 -e 60 -f CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -F AGRGTTYGATYMTGGCTCAG -r AATGATACGGCGACCACCGAGATC -R CGACATCGAGGTGCCAAAC -U ‘0.75;1.5;2;0’ -c 2./p>{sample_identifier}_{sequence_identifier}’), concatenated into a single fasta file and imported. We then used QIIME 2’s ‘vsearch’ plugin132 to dereplicate sequences and then cluster them at 65% similarity (that is, due to rapid evolution at bacterial ITS regions). The 65% OTU feature-table had 365 samples and 285 features. The concatenated fasta file and 65% OTU feature-table were uploaded to Qiita as distinct preparations (study: 13114). We then used QIIME 2’s90 ‘feature-table’ plugin to exclude singleton OTUs and samples with a total frequency of <500 reads, and the ‘deicode’91 plugin to estimate beta-diversity for each dataset using robust Aitchison distances91. The final feature-table for full-length rRNA operon beta-diversity analysis included 242 samples and 196 features./p>90)./p>